宇麥動物醫療專刊 編輯部
自1953年1953年J.D.Watson與F.H.C.Crick在自然(Nature)期刊上發表了關於去氧核醣核酸的構造之後,開啟分子生物學的新頁。隨著分子生物學的進展,許多原來應用在研究上的方法,也漸漸應用在臨床診斷上。此種應用核酸、蛋白質等細胞內巨分子作為診斷工具所建立的方法可統稱為分子檢驗技術。目前應用於分子診斷之分子生物學技術項目繁多,大略而言可包含核酸雜合技術(Nucleic Acid Hybridization)、限制 片段長度多樣性分析(Restriction Fragment Length Polymorphism; RFLP)、聚合 鏈反應(Polymerase Chain Reaction; PCR)等。這些分子診斷技術在臨床上可應用於腫瘤診斷、感染性病原偵測、突變基因判定等。
PCR已是應用非常廣泛之分子生物技術(圖一),首先需要針對待測檢體目標基因之核酸序列設計一小段與其互補之核酸片段,稱為「引子」,由於核酸複製需要兩邊往復反應,因此需要兩條成對的「引子」(圖一,P1和P2),因此稱為「引子對」。反應時首先需將核酸溶液加熱,使雙股粘合之核酸分開成單股,此步驟稱為變性(Denaturation)反應。再將反應溶液溫度下降到50℃附近(依照引子條件而定),單股核酸會依照DNA序列配對方式(A=T,C≡G)粘合,此時引子即可黏附在模板核酸,此步驟稱為粘合(Annealing) 反應。再將溫度上升到68-72℃,DNA聚合 會在引子後方,依據DNA序列配對方式依序接上互補之核 酸,步驟稱為延長(Extension)。完成此三步驟反應後,引子對所夾取的片段,核酸數量將增加一倍。PCR反應經由變性、粘合與延長三種反應不斷循環,可於體外進行DNA的擴增反應,讓原來數量很少的核酸基因數量,擴增達百萬倍以上。
在臨床上有多種應用PCR 技術的診斷方式,最常見的方式為直接增幅目標基因(病原微生物、腫瘤細胞或突變的體細胞)之特定長度片段,例如自病犬身上的血液、尿液、鼻腔沖洗液或結膜拭子,以PCR增幅反應檢測其中是否具有犬瘟熱病毒,得以了解該犬隻感染犬瘟熱時可自何種檢體中取得感染證據(圖二)。
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