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分子檢驗技術在臨床診斷之應用
 
 

宇麥動物醫療專刊 編輯部

自1953年1953年J.D.Watson與F.H.C.Crick在自然(Nature)期刊上發表了關於去氧核醣核酸的構造之後,開啟分子生物學的新頁。隨著分子生物學的進展,許多原來應用在研究上的方法,也漸漸應用在臨床診斷上。此種應用核酸、蛋白質等細胞內巨分子作為診斷工具所建立的方法可統稱為分子檢驗技術。目前應用於分子診斷之分子生物學技術項目繁多,大略而言可包含核酸雜合技術(Nucleic Acid Hybridization)、限制 片段長度多樣性分析(Restriction Fragment Length Polymorphism; RFLP)、聚合 鏈反應(Polymerase Chain Reaction; PCR)等。這些分子診斷技術在臨床上可應用於腫瘤診斷、感染性病原偵測、突變基因判定等。

PCR已是應用非常廣泛之分子生物技術(圖一),首先需要針對待測檢體目標基因之核酸序列設計一小段與其互補之核酸片段,稱為「引子」,由於核酸複製需要兩邊往復反應,因此需要兩條成對的「引子」(圖一,P1和P2),因此稱為「引子對」。反應時首先需將核酸溶液加熱,使雙股粘合之核酸分開成單股,此步驟稱為變性(Denaturation)反應。再將反應溶液溫度下降到50℃附近(依照引子條件而定),單股核酸會依照DNA序列配對方式(A=T,C≡G)粘合,此時引子即可黏附在模板核酸,此步驟稱為粘合(Annealing) 反應。再將溫度上升到68-72℃,DNA聚合 會在引子後方,依據DNA序列配對方式依序接上互補之核 酸,步驟稱為延長(Extension)。完成此三步驟反應後,引子對所夾取的片段,核酸數量將增加一倍。PCR反應經由變性、粘合與延長三種反應不斷循環,可於體外進行DNA的擴增反應,讓原來數量很少的核酸基因數量,擴增達百萬倍以上。

在臨床上有多種應用PCR 技術的診斷方式,最常見的方式為直接增幅目標基因(病原微生物、腫瘤細胞或突變的體細胞)之特定長度片段,例如自病犬身上的血液、尿液、鼻腔沖洗液或結膜拭子,以PCR增幅反應檢測其中是否具有犬瘟熱病毒,得以了解該犬隻感染犬瘟熱時可自何種檢體中取得感染證據(圖二)。

或將待測基因增幅後以限制 處理,再分析限制 片段長度多樣性(PCR-RFLP),例如將感染人類的顆粒球艾莉希體進行核酸增幅後,可以得到1279 bp長之核酸,再以核酸酵素切割後,產生的不同圖譜可將顆粒球艾莉希體細分成7型(圖三),兩者皆可做為診斷之依據。

PCR在臨床診斷之應用廣泛,可以用來診斷先天性基因異常、基因定位突變、病原微生物(細菌、病毒、寄生蟲等)診斷、水質及食品檢驗等。其優點是快速,敏感度高。與臨床獸醫師比較相關的是病原微生物診斷,特別是對於不易判定或需要類症鑑別的項目比較有此需求。在微生物鑑定上,相較於細菌培養需時1-3日,進行鑑定可能需要到7日,病毒培養分離與鑑定至少需時1-3週,利用PCR檢測技術檢測或鑑定則相對快速,快者在收件後數小時即可完成檢測,確定檢體之病原微生物種類。例如在下痢動物的糞便檢體中,可快速檢出其病原是細菌或者是病毒,如果是細菌可直接檢測是沙氏桿菌、巴仕德桿菌或其他菌種,如果是病毒可直接檢測是腺病毒或者是小病毒,端賴實驗室建立的檢測項目而定。因此臨床獸醫師可參照檢測結果儘快針對特定病原進行治療,PCR檢測結果也可提供病原分離之參考。由於分子診斷技術具有快速鑑定的特性,因此在許多重大傳染病已經將此類方法列入檢測標準之中,例如近來肆虐印尼、泰國等東南亞地區之家禽流行性感冒(禽流感),在美國國家獸醫診斷實驗室(National Veterinary Services Laboratories;NVSL)的檢驗標準中,除了傳統之病毒分離、抗體檢測等鑑定方法之外,分子診斷技術也列入其中,直接檢測H5N1亞型。

但是PCR診斷技術也有一些缺點,由於可將預定增幅的核酸片段增加百萬倍以上,因此用於增幅核酸片段重要要素之一-「引子對」,設計良好與否就顯得格外重要,設計不良的引子對,可能因增幅錯誤的核酸片段,反應後呈現錯誤的結果,造成錯誤的診斷。而且PCR技術敏感性高,檢驗實驗室如果沒有良好的品管措施,可能因為檢體處理程序的污染,造成偽陽性的結果。
分子診斷技術已經在學術單位與醫院廣泛應用,在獸醫臨床醫學的應用方興未艾。藉由良好品質管制下產生之檢測報告,可有助於臨床病例的快速診斷,提升醫療效率,除可增加臨床醫師的診斷依據之外,也可提升畜主對臨床醫師的信心,增加臨床醫師的信譽。

 
 
 
 
 
 
   
 

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